2017.6.1.

柑橘類果皮成分nobiletinの抗認知症効果─機能性食品の開発に向けて─

静岡県立大学薬学部医薬生命化学分野 東北福祉大学感性福祉研究所/島根大学医学部環境生理学

大泉康/松崎健太郎

はじめに

アルツハイマー病(Alzheimer’s disease:AD)は記憶・学習機能の低下を主症状とする認知症の一種である。ADの主な病理学的所見として、アミロイド-βペプチド(Aβ)の脳内蓄積による老人斑形成やタウタンパク質(Tau)の過剰なリン酸化による神経原線維変化に伴う神経可塑性の異常が挙げられる。わが国で認証されているAD治療薬にはアセチルコリンエステラーゼ阻害薬のドネペジルやガランタミン、リバスチグミンのほか、非競合的N-methyl-D-aspartate(NMDA)受容体拮抗薬メマンチンがある。これらの薬物はAD患者の認知機能障害を一時的に軽減させ、AD治療に一定の効果を上げているが、ADの病理変化そのものを抑制する根本治療薬は未だに開発されていない。

我々は、認知症の予防・改善効果を有する天然薬物を探索する過程において、柑橘類果皮成のnobiletin(Fig.1)が認知症に有効である可能性を見出した1−3)。本稿では、nobiletinによる認知障害の予防・改善効果やその作用機序について、動物実験や培養細胞実験などから得られた筆者らの重要な研究成果の一部を概説する。

Fig.1 Chemical structure of nobiletin

1.動物実験(in vivo)による検証

人為的に作製された認知症モデル動物に対するnobiletinの効果

1)嗅球摘出(OBX)マウス

AD患者では、皮質や海馬などにおけるコリン作動性神経の変性・脱落により記憶・学習機能が障害されることが知られている。マウス嗅球を摘出(olfactory bulbectomy:OBX)すると、中枢コリン作動性神経の変性に起因する学習・記憶障害を示すことから、OBXマウスはADの臨床的特徴を再現した認知症モデル動物として使用される。OBXマウスにnobiletin50mg/kgを腹腔内投与あるいは50-100mg/kgを経口投与すると、記憶障害が有意に改善されることがY字型迷路試験を用いた解析から明らかとなった。OBXマウス海馬のコリン作動性神経変性に対するnobiletinの効果をアセチルコリンエステラーゼ活性染色にて検討した結果、nobiletinはこの変性を顕著に抑制した。以上の結果から、nobiletinはOBXマウス海馬においてコリン作動性神経の変性を抑制することにより、その認知機能障害を改善させることが示された4)。

2)NMDA受容体遮断薬誘発性記憶障害モデルマウス

グルタミン酸作動性神経に分布するNMDA受容体は記憶の形成に深く関与しており、この受容体の機能低下は軽度認知障害やADの発症に関与することが知られている。NMDA受容体の機能低下に伴う認知障害に対するnobiletinの効果を明らかにするため、NMDA受容体遮断薬MK-801により誘発される学習・記憶障害に対するnobiletinの効果を検討した。Nobiletin(10-50mg/kg,i.p.)をマウスに7日間連続投与したところ、MK-801誘発性記憶障害が改善されることが恐怖条件づけ試験および受動回避試験において確認された。なお、海馬におけるextracellularsignal-regulated kinase(ERK)の活性化が記憶形成に重要であるが、MK-801は海馬のERKの活性化を阻害する。NobiletinはMK-801による海馬ERKリン酸化の阻害を顕著に抑制した。これらの結果より、nobiletinは海馬におけるERKシグナルの活性化を介してMK-801誘発性記憶障害を改善すると考えられる5)。

3)Aβ1-40脳室投与型ADモデルラット

脳内におけるAβの過剰産生および脳内蓄積は、AD発症の原因のひとつと考えられている。Aβ1-40を側脳室内に持続的に注入すると認知機能障害が起きるため、このラットが広くADモデル動物として用いられてきた。そこで、松崎らはAβ1-40誘発性の認知機能障害に対するnobiletinの効果を検討した6)。まず、浸透圧ポンプを用いてラット側脳室内にAβ1-40を持続的に注入し、Aβ1-40誘発性の記憶障害モデルラットを作製した。八方向放射状迷路試験を用いて本モデルラットの認知機能を測定したところ、作業記憶エラーならびに参照記憶エラーが増大したことから、短期記憶および長期記憶が障害されていることが明らかとなった。興味深いことに、このADモデル動物にnobiletin(10-50mg/kg,i.p.)をAβ1-40脳室投与の前後に7日間ずつ投与したところ、Aβ1-40誘発性の短期および長期記憶障害が有意に改善した(Fig.2)。以上より、nobiletinが、Aβ1-40誘発性の記憶障害を予防・改善する作用を示すことが明らかとなった6)。

4)脳虚血誘発性記憶障害モデルマウス

マウスの頸動脈を閉塞すると、高度の記憶機能障害が起きる。総頸動脈閉塞モデルマウスにおける脳虚血誘発性の記憶障害に対するnobiletinの効果を受動的回避試験およびY字型迷路試験を用いて検討した。Nobiletin(50mg/kg,i.p.)を脳虚血の前後に7日間ずつ連続投与したところ、連合記憶障害および短期記憶障害が著しく改善した。また、脳虚血マウスの海馬CA1領域では、calcium/calmodulin-dependent protein kinaseI(ICaMKII)やmicrotubule-associated protein2(MAP2)などの発現量が有意に減少したが、nobiletinはこれらのタンパク質発現量の減少を抑制した。さらに、虚血障害によるlong term potentiation(LTP)の減少がnobiletinにより改善された。これらの結果より、nobiletin はCaMKIIおよびERKシグナル伝達の活性化により、脳虚血による記憶障害を改善することが明らかにされた7)。

Fig.2 Nobiletin provides protection from Aβ1-40-induced impairment of learning ability in Aβ-infused rats.Each value represents the number of(A)reference or(B)working memory errors as the mean ±S.E.M in each blocks of six trials.Figures arereprinted from Neuroscience Letters(2006)Vol:400,p230−4.

遺伝子改変により作製された認知症モデル動物に対するnobiletinの効果

1))APP-SL7-5Tgマウス

スウェーデン型およびロンドン型の2つの変異を有するヒトAPP695を過剰発現するAPP-SL7-5Tgマウス(9ヵ月齢)では、海馬および嗅内皮質におけるAβ斑はわずかにしか観察されないが、12ヵ月齢以降では顕著なAβ斑の形成と認知機能障害が認められるようになる。このマウスにnobiletin(10mg/kg,i.p.)を9ヵ月齢から4ヵ月間毎日投与し、記憶障害に対する影響を検討した。Nobiletinは本モデル動物の文脈依存性恐怖記憶障害を有意に改善した。また、nobiletinにより海馬におけるAβ沈着が減少することが明らかとなった。さらに、脳内の不溶性Aβ1-40およびAβ1-42量をELISA法により測定したところ、nobiletin投与によりいずれも顕著に減少していることが確認された。これらの結果から、nobiletinはAPP-SL7-5Tgマウス海馬においてAβの蓄積を抑制することによって、記憶障害を改善することが明らかとなった8)。

2)3XTg-ADマウス

3XTg-ADマウスは、APPからAβを産生するγ-セクレターゼの主要酵素プレセニリン1(PS1)、APPおよびTauの3つの遺伝子に変異を有し、Aβ斑形成、神経原線維変化および認知障害などの病変を示す。3XTg-ADマウスに対するnobiletinの記憶障害改善作用を検討した。3XTg-ADマウスに3ヵ月間nobiletinを投与(10-30mg/kg;i.p.)した結果、短期記憶障害が顕著に改善された。また、nobiletinの投与により海馬における可溶性Aβ1-40量は有意に減少することが免疫組織学解析やELISA法により明らかになった9)。

3)SAMP8マウス

老化促進モデル動物として知られるSAMP8マウスは、Tauの異常リン酸化やアミロイド斑の形成、脳内酸化ストレスの増大、認知機能の低下などのAD様病変を示す。4~6ヵ月齢のSAMP8マウスにnobiletin(10-50mg/kg,i.p.)を1ヵ月間投与した結果、物体認知記憶障害および文脈依存的恐怖記憶障害が有意に改善した。また、SAMP8マウスでは海馬において、Tauのセリン(Ser)202およびスレオニン(Thr)231のリン酸化レベルが上昇していたが、nobiletinによりその上昇は有意に抑制された。さらにnobiletinは、脳内のグルタチオンや抗酸化酵素の活性を亢進することが明らかになった。以上の結果から、nobiletinはSAMP8マウスにおいてAβ沈着やTauのリン酸化を抑制し、さらに酸化ストレスを軽減して記憶障害を改善すると考えられる10)。

2.培養細胞(in vitro)における検証

1)ラット海馬初代培養神経細胞

海馬神経細胞におけるcAMP response element binding protein(CREB)のリン酸化やCRE依存的な転写を介した記憶関連遺伝子の発現調節やタンパク質合成はシナプス可塑性の分子基盤であり、特に長期記憶の形成に重要とされている。CREBリン酸化やCRE依存的な転写の調節にはprotein kinaseA(PKA)やERK等のさまざまなキナーゼによって制御されることが知られており、いずれも認知機能との関わりが深い。そこで、松崎らは海馬初代培養神経細胞を用いてCREBリン酸化やCRE依存的な転写とそれに関連するシグナルカスケードに及ぼすnobiletinの効果を解析した。Nobiletinは海馬初代培養神経細胞において、CREBのリン酸化およびCRE依存的な転写を顕著に促進し、またPKA活性やERKのリン酸化を促進することが明らかになった。さらに、CRE依存的な転写産物であるc-fosやNeuronal growth factor(NGF)などのmRNA発現量がnobiletinによって増加した。以上の結果より、nobiletinはPKAやERKなどのシグナル伝達を介してCREBのリン酸化およびCRE依存的な転写を促進し、NGFなどの記憶形成に関連する因子の産生を促すことで神経可塑性に影響する可能性が示された。
一方、ADの原因物質であるAβはPKA/CREBシグナルカスケードを阻害し、認知機能を障害することが知られている。そこで、海馬初代培養神経細胞を用いてAβによるCREBリン酸化の阻害とnobiletinによる保護効果を解析した。Aβ1−40は、海馬初代培養神経細胞においてグルタミン酸により惹起されるCREBリン酸化を阻害したが、nobiletinはこれを著しく改善するという興味深い事実が明らかにされた(Fig.3)。NobiletinはAβによるCREBリン酸化阻害に対する改善作用を示すと考えられる6)。

2)ラット副腎褐色細胞腫由来細胞株PC12D

ラット副腎褐色細胞腫由来細胞株PC12Dにおいて、nobiletinはPKA/ERK/CREBシグナルカスケードならびにCRE依存性転写を亢進し、NGF様の突起伸展作用を示した。また、nobiletinはNMDA型受容体サブユニット、ムスカリン性アセチルコリン受容体およびコリンアセチル基転移酵素、c-FosおよびCREB結合タンパク質などの遺伝子発現量を有意に増加することが明らかになった11,12)。これらの結果は、種々の認知症モデル動物に対するnobiletinによる認知機能改善効果に関連すると考えられる。

Fig.3 Nobiletin reverses inhibition of glutamate-induced phosphorylation of CREB by sublethal concentration of Aβ.Data are the mean ±S.E.M.**p<0.01.*p<0.05.Figures are reprinted from Neuroscience Letters(2006)Vol:400,p230−4.

3)ヒト神経芽細胞腫由来細胞株SK-N-SH

ヒト神経芽細胞腫由来細胞株SK-N-SHなどの細胞をnobiletin含有培地で培養し、遺伝子の発現変動をマイクロアレイ解析で検討した。その結果、小胞体
(endoplasmic reticulum:ER)ストレス反応遺伝子Ddit3、TribおよびAsnsなどの遺伝子発現が顕著に増加し、一方で、細胞周期制御遺伝子Ccna2、Ccne2およびチオレドキシン結合タンパク質の遺伝子Txnipなどの発現量が減少した。さらに、ERストレスを惹起する薬剤ツニカマイシン誘発性のアポトーシスやTXNIPタンパク質発現の上昇をnobiletinは抑制することが明らかになった。また、nobiletinはAβ分解酵素ネプリライシン1(NEP1)遺伝子やタンパク質発現およびその酵素活性を亢進することが明らかとなった13,14)。これらの事実は、Aβの蓄積やAβによる酸化ストレス障害をnobiletinが改善する作用を有することを示しており、さまざまなAD病態モデル動物におけるnobiletinの認知機能改善効果に関与すると考えられる。

4)iPS細胞由来のADモデル神経細胞

近年、PS1変異を有しAβを過剰に産生するヒトiPS細胞由来のADモデル神経細胞を用いてnobiletinのAβ分解作用を検討したところ、nobiletinはNEP1遺伝子発現亢進を介してAβ分解を促進し、細胞内外のAβを減少させることが示された。これらの結果から、nobiletinはNEP1の発現・活性を亢進することでAβ分解を促進し、Aβ誘発性記憶障害を改善することが示された。

5)マウス海馬スライス

グルタミン酸受容体のひとつであるalpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid(AMPA)受容体は、GluR1-4サブユニットからなり、記憶形成に密接に関与する。海馬におけるPKA活性の亢進やそれに伴うAMPA受容体サブユニットGluR1Ser845のリン酸化は、AMPA受容体の細胞膜移行を促進し、LTPを誘導することが知られている。マウス海馬スライスCA1領域を用いた電気生理学的な解析により、nobiletinは単独でLTPを誘導するという興味深い事実が明らかとなった(Fig.4A)。また、nobiletinによるLTP誘導メカニズムには、海馬におけるPKAの活性化やGluR1Ser845のリン酸化が関与することが明らかとなった(Fig.4B)。以上の結果より、nobiletinは海馬においてPKA活性を促進し、GluR1のリン酸化を亢進することで、ポストシナプスにおけるAMPA受容体の細胞膜発現を増加させ、その結果LTPを誘導すると考えられる15)。

Fig.4 Nobilet in post synaptic all yaugments the synaptic transmission in hippocampalslices.
(A)The fEPSPs lopew as normalized to the baseline measured just before application of nobiletin, and plotted against time. Whennobiletin(100μM)was applied,the fEPSP was augmented(open circles).The normalized fEPSP slope was plotted against time(closed circles).
(B)Effects of nobiletin on phosphorylation of GluR1 at Ser 845 in the CA1 region of hippoc ampal slices.Data are the mean ±S.E.M.***p<0.001.Figures are reprinted from European Journal of Pharmacology(2008)Vol:578(2-3),p194−200.

おわりに

本稿では、さまざまな実験系におけるnobiletinの抗認知症効果の一部を述べた。これまでに、記憶形成の促進作用や中枢神経疾患の治療に有効な薬物は数多く報告されてきたが、nobiletinのように多様な作用機序を持つ薬物の存在はほとんど知られていない。近年、nobiletinを多く含む柑橘類果皮エキス(C.reticulata)が、ドネペジル療法中のAD患者における認知障害の進行を防ぐ可能性が、少数例ではあるが報告されている16)。さらに筆者らは、厚生労働省長寿医療委託費(17公−1)、農林水産省による平成20年度「新たな農林水産政策を推進する実用技術開発事業」および平成23年度「農林水産物・食品の機能性等を解析評価するための基盤技術の開発」などの国のプロジェクト研究を推進した結果、抗認知症機能性食品開発に必要な基盤技術開発研究が飛躍的に進歩した。以上に述べたnobiletinおよび柑橘類果皮エキスに関する研究成果に基づいて、抗認知症作用を有する機能性食品、ひいては新しいタイプの薬物が開発されることが期待されている。

(引用文献)

  1. 大泉康(2015)認知症の予防・治療技術開発の新しい戦略−天然物を用いたアプローチ−,薬学雑誌,135,449−64.
  2. 大泉康,木村純子(2016)柑橘類成分ノビレチンの抗認知症機能性食品開発研究に必要な薬理学的エビデンス,応用薬理,91,1−9.
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静岡県立大学薬学部医薬生命化学分野 東北福祉大学感性福祉研究所/島根大学医学部環境生理学
大泉康/松崎健太郎 おおいずみ・やすし/まつざき・けんたろう
おおいずみやすし静岡県立大学薬学部客員教授、東北福祉大学感性福祉研究所特任教授。薬学博士。東北大学大学院薬学研究科博士課程修了後、同大学薬学部助手・講師・教授・名誉教授、三菱化学生命科学研究所主任研究員・室長、応用薬理研究会理事・理事長、横浜薬科大学教授などを歴任し、現職。

まつざきけんたろう 島根大学医学部医学科環境生理学学内講師、博士(医学および薬学)。専門は環境生理学。主として暑熱馴化形成の中枢制御機構を解析している。日本生理学会久野寧記念賞(2011年)、Prof.TeruoNakayamaMemorialAward(2015年)、第25回日本生気象学会研究奨励賞受賞(2016年)

初出:特定非営利活動法人日本メディカルハーブ協会会報誌『 MEDICAL HERB』第40号 2017年6月